【流式应用知多少】抗体亲和力检测方案

本期简介：

  单克隆抗体（mAb）具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，目前已经成功用于治疗免疫、癌症等多种疾病领域。本期小贝想要介绍给大家如何快速、、准确的筛选到高亲和性的单克隆，以及如何提高抗体亲和力助于改善抗体的特异性和效力，减少用药剂量降低毒副作用等都是抗体药物研发的关注热点。

其中亲和力是抗体药物是否具有药效的关键功能属性之一，Binding和Function是药效初步评价中重要的两环，对于候选药物来说，结合是其药物发挥功能的必要条件。但在mAb的产生过程中，蛋白质的翻译后修饰会产生差异导致各种糖型的产生。如果在治疗剂的生产中使用不同的细胞系也可以看到糖基化变体，重要的是，糖基化的差异可对FcR结合产生深远影响，从而对mAb治疗效果产生深远影响。因此评价一个候选药物，其与靶点分子的结合能力是基础也是重要的一方面。在研发过程中不论小分子药物还是大分子药物的研发过程中均会使用亲和力(affinity)来评价候选分子和靶点分子之间结合的强弱。

本期内容：

  目前进行抗体亲和力检测的方法有很多种，如平衡透析、硫氰酸盐洗脱法、表面等离子共振技术（SPR）以及流式细胞术等。其中流式细胞法因为可以在体外使用表达特定抗原靶点的细胞来评价抗体与细胞膜表面靶点的亲和力，模拟出更接近体内的抗体结合条件，因此越来越得到研究者的青睐。本文就以阿达木单抗（阿达木单抗是一种人肿瘤坏死因子TNF-α特异性重组IgG1单克隆抗体,对体内肿瘤坏死因子TNF-α 具有高度亲和力）为例介绍如何通过流式细胞术来进行阿达木单抗与细胞膜结合型TNF-α亲和力评价的方法。

  实验流程如下：

1. 准备稳定表达膜型TNF-α的工程化CHO-K1细胞，培养至80%融合后收集，离心后用PBS洗涤及重悬，后用含有1%马血清的PBS调整浓度至4x10⁶个细胞/mL;

2. 取流式管然后分别标记为自发荧光（AF），TNF-α组，同型对照（ISO），缺少阿达木单抗组（WA）以及3-700 ng/mL 不同浓度的阿达木单抗组；其中AF组为不染色的CHO-K1细胞， TNF-α组为只有TNF-α APC抗体染色的细胞，ISO组为只加了阿达木单抗的细胞，WA组为只加了IgG PE抗体染色的细胞，阿达木组为分别加了不同浓度的阿达木抗体后进行IgG PE染色的细胞；

3. 根据下表的要求进行染色和上机操作

结果及分析：

  首先，通过设门策略圈出需要分析的单个CHO-K1细胞（Fig A and B），然后进行相应通道的平均荧光强度（MFI）的比较。根据AF组与TNF-α组在APC通道上MFI的结果可以确定该CHO-K1细胞确实表达m TNF-α (Fig.1 C); 阿达木单抗组在PE通道的荧光强度增加表明IgG-PE可以与阿达木单抗进行特异性结合，这些结果证实了该生物模型和流式细胞术检测方法在体外评价阿达木单抗与靶细胞的结合是合适的。

Fig.1

  其次，分别计算3-700 ng/mL不同浓度的阿达木单抗组在PE通道的MFI (Fig.2 A), 然后通过不同浓度的MFI增加倍数以及阿达木单抗浓度(Log)用Graph Pad Prism软件（在四个或五个参数的逻辑模型下测试）进行曲线拟合（Fig.2 B）即可得到流式检测阿达木单抗-mTNF-α复合物的结合量效曲线。

Fig.2

  流式细胞术不仅可用于与细胞表征和功能相关的检测，也适合作为生物测定中的检测方法。在生物测定中使用流式细胞仪的优势在于自动化，灵敏度，染色控制和自我校准，可以获得准确一致的测量结果。该生物测定的开发和验证的集体结果表明，它可以作为QC实验室中常规方法，或作为阿达木单抗的表征和生物相容性的测试。并且该实验条件可以标准化用于评估其他生物分子通过相同的机制行动起作用并有助于扩展流式细胞仪在生物标记表征和生物仿制药可比性证明中的应用。

  如需要进一步了解实验方案，请通过点击左下角“阅读原文"的信息与贝克曼库尔特公司的技术支持联系。

本文所列方法和数据参考以下文献：

Camacho-Sandoval R, Sosa-Grande EN. Development and validation of a bioassay to evaluate binding of adalimumab to cell membrane-anchored TNFα using flow cytometry detection. J Pharm Biomed Anal. 2018 Jun 5;155:235-240. doi: 10.1016/j.jpba.2018.03.057.